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穩定細胞株構建

發布時間: 2021-03-01  點擊次數: 142次

穩轉細胞係(穩定表達細胞株)指在細胞中持續穩定表達特定基因或幹擾特定基因表達。穩轉細胞株的目的基因質粒DNA整合到細胞染色體上,使細胞長期穩定表達該基因。穩轉細胞株包括多克隆穩轉細胞株和單克隆穩轉細胞株。慢病毒感染目的細胞後,通過抗性基因篩選得到的細胞株是多個細胞克隆的組合。單克隆細胞株是從多克隆細胞中經細胞克隆挑選得到的,由一個細胞擴增得到的細胞株。單克隆細胞株性狀統一,傳代過程中細胞的基因表達保持穩定。

       用轉染質粒或病毒侵染的方法將構建好的含靶基因的載體導入細胞,根據不同的基因載體中所含的抗性標誌選用相應的藥物進行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎上,得到單細胞長出的陽性單克隆,繼而得到穩定轉染細胞株。常用的真核表達載體的抗性標誌物有嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)和新黴素(neomycin)。

       篩選穩定細胞株的兩種方法
       1、轉染質粒後,單克隆方法篩選穩定細胞係
       對大多數細胞轉染效率較低。對於基因過表達,如果轉染效率達到40%,基因過表達尚可。但是對於基因幹擾實驗,對轉染效率要求遠遠高於基因過表達,通常質粒轉染無法滿足。
       另外,質粒遊離於細胞質中,很快降解,無法滿足較長時間的檢測項目;質粒轉染整合幾率極低,穩定細胞株構建耗時耗力,且得率很低,往往需要挑取單克隆株。
       2、病毒感染篩選穩定細胞株
       病毒感染方法較質粒轉染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩定細胞係篩選方法。用慢病毒製備穩轉細胞株,由於其高效整合、高效轉錄、高效表達、宿主範圍廣,感染效率高,且與細胞染色體整合而不發生基因重排,是製備穩定細胞株的理想載體。
       穩定轉染細胞株服務流程
      1、載體構建:將外源基因構建到合適的載體上,如需病毒轉染,則包裝病毒。
      2、篩選濃度測定:以 10-14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
      3、細胞接種:轉染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞應達到 60%-80% 覆蓋。
      4、細胞轉染:用構建好的載體(或包裝好的病毒)轉染目的細胞。
      5、抗生素篩選。
      6、鑒定篩選結果。
     終交付
     1、病毒滴度檢測報告;穩轉細胞株;
     2、結題報告,包括詳細的實驗流程,測序結果和峰圖、引物序列、載體圖譜和滴度測定報告和q-P

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